Текст уведомления здесь

Хватит уже редактировать!

Дженнифер Дудна и ее коллеги придумали, как выключить CRISPR-Cas

В журнале Science Advances вышла статья, описывающая испытания белка ArcIIA4, который ученые называют «антиCRISPR»: он может подавлять активность CRISPR-Cas9 — самого популярного сегодня инструмента редактирования генома. Исследователи изучили то, как работает белок, и испытали его действие в клетках лейкемии человека in vitro. Теперь они утверждают, что AcrIIA4 может использоваться для повышения надежности и регуляции деятельности CRISPR-Cas9.
Добавить в закладки
Комментарии

Исследование проводила группа Дженнифер Дудны

Бум применения CRISPR-Cas9 в молекулярной биологии связан с несколькими именами — Чжан Фэн, Дженнифер Дудна и Эммануэль Шарпентье. В 2012 году Дудна и Шарпентье описали, как бактерии и археи используют системы CRISPR-Сas (от англ. CRISPR-associated — CRISPR-ассоциированные), чтобы защититься от вирусов, и указали, что в дальнейшем это можно использовать для целевого редактирования генома. Год спустя Чжан Фэн отчитался об успешном испытании системы CRISPR-Cas9 в клетках мышей и человека: «ведомая» РНК-гидом, она успешно находила нужный сегмент генома и расщепляла участок ДНК. В том же году их коллеги продемонстрировали преимущество CRISPR над другим перспективным инструментом редактирования генома, TALEN (от англ. transcription activator-like effector nucleases), и тем самым окончательно закрепили лидерство «крисперов».

Спустя четыре года технология стала de facto стандартным лабораторным инструментом молекулярных биологов (в 2012-м году о CRISPR было написано 126 статей, а в 2016-м — уже 2155). А Дудна, Шарпентье и Чжан Фэн все это время судились за то, кому же должен принадлежать патент на систему (право на редактирование генома в эукариотах выиграл Институт Броуда, за команду которого играл Чжан Фэн, но как в действительности будет исполняться решение суда, пока еще неясно).

CRISPR и его возможности восхищают и пугают одновременно

Два года назад китайские ученые с помощью CRISPR-Cas9 отредактировали человеческий геном в живых клетках эмбрионов. Они пытались лечить бета-талассемию, генетическое заболевание крови. Эксперимент оказался скорее неудачным: из 86 эмбрионов только в четырех сломанный ген оказался отремонтирован. Но научное сообщество все равно несколько напряглось, поняв, что словосочетание «позитивная евгеника» внезапно стало намного более реальным в мире, где есть CRISPR-Сas. Дудна моментально отреагировала, организовав встречу семнадцати ученых и специалистов по этике (среди участников был Пол Берг, организатор Асиломарской конференции 1975-го, так что только ленивый не провел параллель между CRISPR и рекомбинантными ДНК).

В результате был опубликован манифест, призывающий ограничить использование системы вне лабораторий и особенное внимание уделить исследованиям нецелевых мутаций, вносимых подобными инструментами. Подписанты апеллировали к тому, что технология еще очень молода, а последствия ее применения к живым организмам полностью не изучены (с тех пор многие выступления Дудны посвящены вопросам этики и безопасности, а недавно она выпустила целую книгу о том, как создавалась технология CRISPR-Cas9 и какие этические дилеммы необходимо разрешать в связи с ее возникновением).

Выступление Дженнифер Дудны на TED

Что, впрочем, не особо замедлило победоносное шествие технологии. Гонку за создание лекарств на движке CRISPR уже окрестили «Спутником 2.0», только в ней американцы соревнуются не с Советским Союзом, а с Китаем. В 2016-м китайцы уже запустили программу клинических испытаний клеточной терапии, в ходе которой отредактированные CRISPR T-лимфоциты пересаживали больным раком легких, в США подобная программа получила одобрение Национального института здравоохранения.

Недавно группа биологов била тревогу

В мае этого года группа американских ученых опубликовала в журнале Nature Methods статью, где указывала на то, что они обнаружили более 1500 нецелевых одиночных нуклеотидных замен и более 100 делеций и вставок в геноме мышей, которым при помощи системы CRISPR-Cas9 исправляли ошибку в ДНК, вызывающую слепоту. Как писали авторы, ни одно из обнаруженных ими изменений не было предсказано специальным алгоритмом, который используется в ходе подобных экспериментов. Тревожный эффект был велик: на статью отреагировали многие исследователи (раз, два, три), которые указали на то, что авторы статьи в Nature Methods делают чересчур сильные заявления для той доказательной базы, что у них есть. Но консенсус, зафиксированный в ответе обвиняемых в паникерстве ученых, обнаружился все там же: технологию редактирования генома эукариот при помощи CRISPR-Cas надо продолжать дорабатывать.

Работа группы Дудны также посвящена проблеме нецелевых мутаций

И вот теперь в Science Advances вышла статья ученых, работавших под руководством Дудны. Она не посвящена критике вышеупомянутой работы американцев, но точно способна снизить градус тревоги по этому поводу. Впрочем, чего еще ждать от ученого, которая больше всех из «родоначальников» технологии была озабочена ее потенциальным вредом?

В статье рассказывается, что исследователям удалось разобраться с тем, как именно действует ингибитор CRISPR-Cas-систем, белок AcrIIA4, и испытать эффективность его работы в эукариотических клетках. Само происхождение белка, как и «крисперов», не эукариотическое — он был «разработан» естественными жертвами CRISPR-систем, бактериофагами, в ходе эволюционной «гонки вооружений» между бактериями и их вирусами. Его обнаружили в прошлом году.

Статья подробно описывает, как работает «антиCRISPR»

Свое исследование группа Дудны начала с того, что проверила, напрямую ли взаимодействует белок AcrIIA4 с Cas9, и выяснила, что он «липнет» к Cas9 только в присутствии РНК-гида (sgРНК), «наводящего» систему. Возможных объяснений этому могло быть два: либо AcrIIA4 наводится на цели, похожие по форме на сборку sgРНК+Cas9, либо способен «учуять» свою цель в тот момент, когда Cas9 начинает пристыковываться либо к sgРНК, либо уже к ДНК-мишени.

Дальнейшее наблюдение продемонстрировало, что комплекс AcrIIA4-Cas9-sgРНК по своей форме почти не отличается от модуля Cas9-sgРНК, из чего ученые вывели, что связывание с белком никак не изменяет сам модуль. AcrIIA4 скорее мимикрирует под мишень системы, обманывает ее, а не ломает — и таким образом защищает ДНК.

AcrII4A подменяет собой цель CRISPR-Cas9. Изображение: Fuguo Jiang / UC Berkeley

AcrII4A подменяет собой цель CRISPR-Cas9. Изображение: Fuguo Jiang / UC Berkeley

Рассмотрев заблокированную белком систему при помощи криоэлектронной микроскопии и построив ее подробную модель, исследователи выяснили, что AcrIIA4 садится на ту часть Cas9, которая обычно взаимодействует с небольшой нуклеотидной последовательностью PAM (от англ. protospacer adjacent motif — мотив, прилежащий к протоспейсеру). По PAM CRISPR-Cas9 «наводится», поэтому, когда AcrIIA4 полностью занимает его участок связывания, система не может атаковать ДНК. Также, как считают ученые, из этой позиции «антиCRISPR» может препятствовать расплетению «криспером» нити ДНК (которое необходимо для разрезания нити) и активации одного из «резаков» системы, мотива HNH.

На следующем шаге проверялось, насколько эффективна работа «антиCRISPR» белка. Делалось это на «испытательном полигоне» — линеаризованной плазмиде, то есть кольцевой молекуле ДНК, разрезанной так, чтобы получилась линейная молекула. Без AcrIIA4 система CRISPR-Cas9 обнаруживала ДНК-мишени и успешно «отрабатывала» их примерно через пять минут, а при добавлении AcrIIA4 ее успех начинал снижаться, после определенной концентрации AcrIIA4 вообще становясь нулевым. Однако белок успешно противостоял CRISPR-Cas9, только если появлялся на месте до того момента, как «криспер» находил свою мишень.

Дальше исследователи перешли к проверкам на клетках лейкемии человека со встроенным в них геном синего флуоресцентного белка в качестве мишени. Ничем не блокируемый CRISPR-Cas9 почти полностью подавил свечение в клетках, вырезав мишени, а если в одно время с ним на арену выходил AcrIIA4, система начинала сбоить: эффективность ее, как и при испытаниях на линеаризованной плазмиде, зависела от концентрации враждебного белка.

Если же белок вводился в клетки за 24 часа до CRISPR-Cas9, то эффективность редактирования генома падала так, будто она отправилась на охоту без РНК-гида. А добавление ArcIIA4 через шесть часов после «криспера» с гидом сократило эффект на 50%. Короче говоря, сила «остужения» активности CRISPR-Cas9 зависела от того, в какое время «антиCRISPR» появлялся на месте противостояния.

Ученые пишут, что как минимум половина целевых раскусов ДНК «криспером» вносятся в первые шесть часов его работы. Поэтому, полагают они, если остановить ее по прошествии этого времени, то, хотя и потеряв в эффективности, можно избежать большей части нецелевых мутаций, вносимых системой, поскольку они, по-видимому, возникают просто потому, что у CRISPR-Cas нет своего «выключателя» и он продолжает работать дальше, подбирая все менее подходящие цели. С опорой на это Дудна с коллегами утверждают, что ArcIIA4 может стать таким «выключателем».

И вот тут-то нецелевые мутации наконец закончатся, а генная терапия болезней, которые мы так давно мечтаем победить, начнется. Осталось, кажется, совсем немного подкрутить настройки.

Немного любопытных совпадений

Позавчера же — в день публикации статьи группы Дудны в Science Advances — экспертный совет американского Управления по контролю за продуктами питания и лекарствами единогласно рекомендовал управлению одобрить выход на рынок генной терапии лейкемии. Фармкомпания Novartis, которой принадлежит это лекарство, CTL019, еще в 2015 году приобрела эксклюзивное право на то, чтобы создавать CAR, химерные антигенные рецепторы (в которых, собственно, и заключается «фишка» генной терапии), используя CRISPR-Cas-технологию компании Intellia Therapeutics, одной из основательниц которой является все та же Дженнифер Дудна.

Так что не исключено, что следующая версия CAR-T-терапии, созданная Novartis, будет уже использовать CAR, созданные при помощи CRISPR-Cas. Ведь если верить недавнему исследованию, они получаются намного более эффективными. А добавление к арсеналу Intellia еще и «рубильника» ArcII4A выглядит как самая настоящая вишенка на торте. Осталось только с патентами разобраться.

Добавить в закладки
Комментарии
Вам понравилась публикация?
Расскажите, что вы думаете, и мы подберем подходящие материалы

Чьи гены?

Научный взгляд на телегонию: чего ждать, если ваша бабушка «согрешила с водолазом»

Телегония — наследование ребенком признаков от предыдущих партнеров матери — относится к темам, которые не принято обсуждать вслух. Считается, что и так все понятно. Но при ближайшем рассмотрении оказывается, что каждому «понятно» что-то свое. Вооружившись проверенными источниками и здравым смыслом, мы попробуем свести разные представления о телегонии к общему (рациональному) знаменателю и выслушаем современную науку, которой внезапно тоже есть, что сказать нового по этому поводу.
Добавить в закладки
Комментарии

Для начала договоримся о терминах. Удивительно, но уже здесь нет единства: по результатам запроса в Яндексе мы видим, что разнообразные источники телегонию называют «наукой», «концепцией», «тайной человечества» и даже «инструментом совершенствования биологического вида». Мы остановимся на «классическом» варианте, который предполагает, что предыдущий половой партнер матери может как-то влиять на ее потомство от последующего. Поясним сразу, что нас интересуют не этические аспекты этого вопроса, а только физиологические и молекулярные механизмы.

Взлет и падение

Датой рождения телегонии как понятия можно считать 1868 год, когда Чарльз Дарвин (да-да, и этот фундамент тоже заложил он) в своей книге «Изменение животных и растений в домашнем состоянии» привел разнообразные свидетельства этого явления. Большинство из них представляли собой рассказы «очевидцев», полученные Дарвином через третьи руки, и поэтому научным аргументом являться не могли. Единственным задокументированным случаем, вошедшим с тех пор во все популярные тексты, остается история кобылы лорда Мортона. Если коротко, кобыла арабских и английских кровей была случена с кваггой (ныне истребленный подвид зебры) и принесла потомство с характерными полосками. В следующий раз, уже от самца своей породы, она снова принесла жеребят, внешне напоминавших кваггу. Ситуация повторилась и через восемь лет: в отсутствие жеребца-квагги опять родились полосатые дети.

Жеребенок — гибрид зебры и лошади. Фото из книги Джеймса Юарта The Penycuik experiments
Жеребенок — гибрид зебры и лошади. Фото из книги Джеймса Юарта The Penycuik experiments

[ ... ]
Читать полностью
Фрагмент Королевских ворот в Хаттусу, столицу Хеттской империиStylone / Фотодом / Shutterstock

Бронзовый коллапс, или Куда делись все эти люди

Чем был вызван кризис средиземноморских цивилизаций три тысячи лет назад

В конце второго тысячелетия до нашей эры в Греции и на Ближнем Востоке — в Месопотамии, в Древнем Египте, в Сирии, в Малой Азии — творились очень странные дела. Великие царства бронзового века одно за другим уходили в небытие, из ниоткуда появлялись новые народы, хроники повествовали о нашествиях, голоде и прочих бедствиях. Историки долго предпочитали винить во всем «народы моря», но теперь, благодаря археологическим данным, полученным в последние годы, у нас, кажется, есть основания иначе отвечать на вопрос, кто виноват в коллапсе «бронзовых» цивилизаций.
Добавить в закладки
Комментарии

Как рассказывает профессор Эрик Клайн из Университета Джорджа Вашингтона, директор Капитолийского археологического института, автор книги «1177 BC: The Year Civilization Collapsed», Средиземноморье позднего бронзового века представляло собой мир, очень похожий на современный, — глобализованное пространство с торговыми нитями, опутавшими всю ойкумену, то есть все страны, составлявшие на тот момент европейскую цивилизацию.

Торговые и культурные связи второго тысячелетия до нашей эры обеспечивали единый высокий технологический уровень городов Греции и Ближнего Востока во всем: в кораблестроении, в архитектуре, в обработке металлов. Чтобы показать протяженность и устойчивость торговых путей бронзового века, достаточно сказать, что олово для выплавки бронзовых изделий поступало, скорее всего, из Афганистана, а медь брали на Кипре.  Города были оснащены системами водоснабжения, инженерный уровень которых античным грекам тысячу лет спустя и не снился.

Все это откатилось назад со страшной скоростью в кратчайшие по меркам истории сроки, чтобы сбросить с древнего мира бронзовый век и позволить ему войти в новый век — железный, в ту историю, которую мы изучаем в школе.

За относительно короткое время — в древнеегипетских надписях зафиксирован промежуток от 1207 до 1177 года до нашей эры — весь прекрасный бронзовый мир растворяется. Торговые связи рушатся. Из известных нам царств бронзового века в более-менее нетронутом виде остается Египет, который теряет контроль над Сирией и Палестиной. Вавилон и Ассирия сохраняют разве что локальное значение. Исчезает микенская цивилизация. Разрушена Троя. [ ... ]

Читать полностью

Чего от нас хотят микробы?

Они управляют нашим поведением и добиваются желаемого

Недавно в журнале Nature вышла очередная статья, возлагающая вину за целый ряд человеческих болезней, в том числе психических, на микробов — обитателей нашего кишечника. За полвека изучения кишечных бактерий ученые так и не смогли определиться, чего они приносят больше — пользы или вреда. Но успели убедиться в том, что среди прочего микробы могут вызвать изменения в поведении человека и его психическом здоровье. Мы переводим их сигналы с микробьего языка на человеческий и предлагаем читателю самому решить, друзья нам бактерии или враги (но не обещаем, что они не повлияют на его мнение).
Добавить в закладки
Комментарии

Про микробов и людей

Помните советский мультфильм про лося, на рогах которого ездили лесные звери и устроили себе там дом? Наш организм — такой же лось для триллионов одноклеточных организмов (большинство из них составляют бактерии), которых собирательно называют микробами, микрофлорой или микробиотой. Можно даже сказать, что мы и наши микробы составляем один метаорганизм, который необходимо рассматривать как единое целое, поскольку людей, лишенных микробов, не существует.

Люди и микробы объединились во имя самого ценного, что нужно живому организму, — во имя еды. Люди умеют ее добывать, а микробы — переваривать. Однако для мирного сосуществования им необходимо выполнять договор о ненападении. Поэтому, действуя на скопления иммунных клеток стенки кишечника, бактерии смягчают возможный иммунный ответ. Если этого не происходит, например, из-за недостатка бактерий, иммунитет человека становится более агрессивным. Вероятно, именно из-за этого у детей, выросших в условиях пониженного содержания бактерий (в чистоте, вне контакта с матерью и ее молоком), чаще развиваются аллергии и аутоиммунные заболевания. Со своей стороны, микробы не разрушают стенки кишечника. Впрочем, они остаются мирными соседями лишь до тех пор, пока не проникнут внутрь организма человека. Там они вызывают тяжелые воспаления, с которыми непросто бороться.

Кроме того, микробы требуют защиты своих интересов. Например, им важно, чтобы к ним регулярно поступала пища, а стенка кишечника их не травмировала. Для этого они выделяют сигнальные молекулы, регулирующие деятельность окружающих клеток хозяина, например всасывание или секрецию ферментов, или даже отложение жира (да-да, есть данные о том, что ожирение связано с нарушением баланса кишечной микробиоты). Ну и, наконец, такое сосуществование иногда приводит к странным эффектам. Например, микробы могут поглощать лекарства, принимаемые хозяином, или как-то их модифицировать, что иногда существенно снижает эффективность лечения. Или же выделять свою ДНК (в рамках обмена генами с другими бактериями), которая, возможно, поглощается окружающими тканями хозяина. Однозначных подтверждений тому, что гены бактерий работают в клетках стенки кишечника, пока нет. Однако известны подобные случаи у насекомых и червей. А в геноме человека найдены некоторые последовательности, подозрительно похожие на бактериальные. Вероятно, между нами и нашими микрообитателями чуть больше общего, чем кажется на первый взгляд. [ ... ]

Читать полностью