Найти и заменить

Как работает генетическое редактирование и в чем его проблемы

Бактериофаг атакует бактерию. Иллюстрация:  Thomas Splettstoesser/Wikipedia, переведено «Чердаком»

Воскресить мамонтов и отредактировать человеческий геном — эти и другие задачи позволяет решать технология CRISPR-Cas9. Однако у нее есть ряд принципиальных ограничений и, кроме того, ее применение тормозят патентные споры. Как ученые пытаются обойти эти сложности и что интересного при этом обнаруживают, рассказал генетик Константин Северинов.

Впервые кассеты CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats, короткие палиндромные повторы, регулярно расположенные группами) были обнаружены у бактерий в конце восьмидесятых годов прошлого века. Это особые участки хромосомы, которые состоят из одинаковых, повторяющихся последовательностей ДНК, разделенных не похожими друг на друга последовательностями — спейсерами.

Cхематическое изображение кассеты CRISPR у бактерии
Cхематическое изображение кассеты CRISPR у бактерии. Иллюстрация: AJC ajcann.wordpress.com / Flickr, переведено «Чердаком»


Бактерия получает спейсеры из ДНК нападающих на нее вирусов-бактериофагов при помощи специальных Cas-ферментов и сохраняет их «на память» в кассете CRISPR. Собранная таким образом «библиотека» спейсеров позволяет бактериям при новых нападениях распознавать ДНК вирусов и с помощью других Cas-ферментов расщеплять ее, выключая работу вирусных генов и предотвращая инфекцию. Такого рода иммунные системы есть у половины известных бактерий и у 90% видов архей.

Cхематическое изображение кассеты CRISPR у бактерииБактериофаг атакует бактерию
Бактериофаг атакует бактерию. Иллюстрация: Thomas Splettstoesser / Wikipedia, переведено «Чердаком»


Фермент Cas9, отвечающий за расщепления вирусной ДНК в некоторых CRISPR-системах, позволил ученым целенаправленно редактировать геномы различных организмов, включая человека.

Исследователи нашли способ программировать Cas9 не спейсерами бактериальных вирусов, а участками, соответствующими, например, поврежденному гену человека. Разрывая ДНК в нужном месте, можно выключать те или иные гены и даже вставлять вместо одной последовательности ДНК другую. В общем, CRISPR-Cas9 работает подобно функции «найти и заменить» в текстовом редакторе, но редактирует при этом генетические тексты – последовательности ДНК.

Как использовать CRISPR-Cas9

В 2013 году ученые продемонстрировали, что CRISPR-Cas9 можно использовать для редактирования клеток мышей и человека. С тех пор список живых организмов, геномы которых можно таким образом править, постоянно растет.

С помощью CRISPR-Cas9 можно выводить устойчивые к вредителям сорта зерна или апельсины с повышенным содержанием витаминов. Можно получать домашних животных, которые не будут болеть теми или иными болезнями, и скот, который будет давать целебное молоко. Можно стирать с лица земли целые популяции «вредных» для человека существ, таких как малярийные комары. Можно создавать животных, которые болеют человеческими болезнями, чтобы испытывать на них лекарства. В будущем эта технология поможет воскрешать вымерших животных, таких как мамонты, или, вернее, позволит сделать современных слонов более похожими на мамонтов.

Китайская компания BGI изначально создавала генетически модифицированных мини-пигов для использования в научных целях, однако затем решила продавать свиней всем желающим в качестве домашних питомцев
Китайская компания BGI изначально создавала генетически модифицированных мини-пигов в научных целях, однако затем решила продавать свиней всем желающим. Правда они использовали не CRISPR, а другой метод генетического редактирования. Иллюстрация: CC0 Public Domain


Наконец, с использованием технологии CRISPR-Cas9 уже проводились опыты по редактированию человеческих эмбрионов. О подобных экспериментах сообщали две группы ученых из Китая. Одна группа пыталась сделать зародыши устойчивыми к ВИЧ, другая — отредактировать гены, связанные с развитием группы заболеваний крови. Эксперименты проводились на нежизнеспособных зародышах, которых затем уничтожили. Также с CRISPR-Cas связывают надежды на излечение наследственных заболеваний у взрослых людей.

Неудивительно, что в прошлом году в своем традиционном прогнозе лауреатов «нобелевки» агентство Thomson Reuters прочило награду создателям этого метода.



Конфликт патентов

CRISPR-Cas9 имеет огромный потенциал, не только научный, но и коммерческий. За патент на коммерческое использование технологии развернулась война между крупными американскими университетами. Первыми в Ведомство по патентам и товарным знакам США подали заявку Дженнифер Дудна из Калифорнийского университета в Беркли и Эммануэль Шарпантье из шведского университета Умео. Через несколько месяцев — Фэнг Жанг из Института Брода в Кембридже, США, и его коллеги. Они были вторыми, но подали заявку на рассмотрение по ускоренной процедуре и получили патент первыми. Дудна и ее коллеги подали в ведомство жалобу.

Путаницу вносят изменения в самих правилах подачи заявок. В марте 2013 ведомство ввело правило: кто первый подал заявку, того и патент. До этого исследователям нужно было не просто подать заявку быстрее конкурентов, но и доказать, что они первыми изобрели то, что пытаются запатентовать. Получилось, что первые патенты на CRISPR-Cas9 были поданы до введениях новых правил, а патент выдан уже после.
Патентное ведомство начало расследование этого случая 10 марта 2016, но сколько оно продлится, предсказать невозможно. Дело может затянуться на годы.

Не только Cas9

При всех очевидных достоинствах Cas9 имеет ряд недостатков. Например, фермент недостаточно точен, что может приводить к расщеплению ДНК в нежелательных местах и возникновению там незапланированных мутаций. Однако есть и другие ферменты, кроме Cas9, которые выполняют сходные функции, никем не запатентованы и, возможно, работают точнее, чем Cas9. Например, в 2015 году Фэнг Жанг и его коллеги опубликовали работу, в которой описывалось генетическое редактирование при помощи фермента Cpf1, неродственного Cas9 и поэтому не подпадающего под действие патентов на Cas9.

Теперь Фэнг Жанг и его коллеги, в частности специалисты лаборатории Константина Северинова в Сколтехе и Университете Ратгерса, нашли еще один новый белок, подходящий для генетического редактирования — C2c2.

Генетический код фермента C2c2 предсказали на основе биоинформатического поиска в открытой базе данных Национального центра биотехнологической информации США.

«Мой сколтеховский аспирант, математик Сергей Шмаков, создал поисковик, который по последовательности ДНК ищет новые системы, подобные CRISPR-Cas9, но не родственные ей», — сказал Северинов.

Фермент C2c2, в отличие от Cas9, позволяет редактировать не ДНК, а РНК. РНК — это промежуточное звено между генетическим кодом и белками, образованными в соответствии с этим кодом. У некоторых вирусов РНК выполняет роль носителя генетической информации вместо ДНК.

«CRISPR-системы возникали в процессе эволюции несколько раз независимо, хотя и выполняют одну и ту же функцию — защищают бактерии от вирусов. Действуют они по похожему принципу», — рассказал ученый.

Белок C2c2 в естественных условиях, по-видимому, защищает от вирусов бактерии лептотрихии Leptotrichia shahii. Они живут во рту человека и вместе с другими бактериями образуют налет на зубах. Однако для того, чтобы использовать C2c2, связываться с лептотрихиями ученым необязательно.

«Мы с коллегами сделали трансгенную бактерию: синтезировали предсказанные гены лептотрихии и перенесли в модельный организм — лабораторную кишечную палочку. А затем проверили, будут ли эти гены придавать устойчивость кишечной палочке к тому или иному вирусу при условии, что у синтетической бактерии будут соответствующие CRISPR-спейсеры. Оказалось, что будут, если вирус содержит геном в виде РНК, а не ДНК», — пояснил исследователь.

Суицид клетки

Метод, позволяющий редактировать РНК, существовал и до открытия C2c2. Возможно, CRISPR-C2c2 будет справляться с этой задачей немного лучше, но самое интересное, по мнению Северинова, заключается не в этом.

«Самым удивительным с научной точки зрения результатом, было открытие, что CRISPR-C2c2 — это «суицидальная» система. Когда она опознает чужеродную РНК, белок C2c2 «теряет разум» и начинает без разбору уничтожать всю РНК вокруг, от чего клетка погибает», — сказал ученый.

Для отдельной бактериальной клетки такой исход печален, но для всей популяции бактерий — выгоден. Ведь погибшая зараженная клетка могла превратиться в фабрику по производству новых вирусов, которые затем заразили бы остальных бактерий. Благодаря системе CRISPR-C2c2 бактерия «совершает самоубийство» прежде, чем это произойдет.


Бактериофаг вводит свой генетический код в клетку бактерии и превращает ее в «фабрику» по производству новых вирусов

«Это можно использовать для направленного уничтожения раковых клеток. В раковых клетках есть специальные РНК, которых нет в обычных клетках, и можно пытаться убить такие клетки при помощи фермента C2c2», — предположил Северинов.

Результаты исследования опубликованы в журнале Science.

Константин Северинов, доктор биологических наук, профессор Сколтеха и университета Ратгерса (США), заведует лабораториями Института молекулярной генетики и Института биологии гена РАН. Недавно у Северинова и его коллег также вышла статья, посвященная исследованию генома гигантского бактериофага AR9.
Теги:

Читать еще на Чердаке: